Research of Klebsiella pneumoniae in dairy herds / Pesquisa de Klebsiella pneumoniae em rebanhos leiteiros

Klebsiella pneumoniae is a common environmental agent of clinical and subclinical mastitis affecting dairy herds, and may be present in the final product decreasing its quality. Mastitis caused by K. pneumoniae is even more severe due to its poor response to antibiotic therapy, rapid evolution to toxic shock and death of the animal. This paper aimed to study the prevalence of this pathogen among dairy herds in ten farms located in different municipalities of São Paulo State based on size and use of milking technology. All mammary glands of all lactating cows were screened using the California Mastitis Test (CMT) and a strip cup. A single aseptic milk sample (20mL) was collected from all CMT-positive quarters and bulk tanks, whereas swab samples were collected from feces, hind limbs of the animals, bedding and milking parlor. Identification of K. pneumoniae was performed using conventional microbiology culture, biochemical assay and Polimerase Chain Reaction. The primers were designed and tested at the Laboratory of Molecular Biology applied to Zoonoses (FMVZ, Unesp-Botucatu) targeting the 16S rRNA gene. This study included 1067 animals. Six cases of intramammary infection by K. pneumoniae were detected in six different cows in two farms. Moreover, K. pneumoniae was isolated in 77 swabs (34 from bedding in 9 farms, 7 from waiting rooms in 5 farms, 6 from milking parlors in 4 farms, 11 from rectums in six farms, and 19 from hindlimbs in 7 farms. Molecular analysis confirmed the agent was K. pneumoniae. At least one strain of the agent was identified in a certain site in all farms, showing the need of maintaining the hygiene in dairy farms...

Klebsiella pneumoniae é um agente ambiental comum de mastite clínica e subclínica que afetam vacas leiteiras e pode estar presente no produto final, reduzindo a sua qualidade. Mastite causada por K. pneumoniae é ainda mais grave devido à sua má resposta à antibioticoterapia, rápida evolução para choque tóxico e morte do animal. Este trabalho teve como objetivo estudar a prevalência deste patógeno entre os rebanhos leiteiros em dez fazendas localizadas em diferentes municípios do Estado de São Paulo com base no tamanho do rebanho e uso de tecnologia de ordenha. Todas as glândulas mamárias das vacas em lactação foram examinadas usando o California Mastitis Test (CMT) e caneca de fundo telado. Foram colhidas amostras de leite (20mL) de todos os quartos CMT- positivos e dos tanques de expansão, também foram colhidos swab de fezes, membros posteriores dos animais, cama dos animais e sala de ordenha. O isolamento e identificação de K. pneumoniae foi realizada através de cultura microbiológica convencional, ensaio bioquímico e Reação em Cadeia da Polimerase, utilizando primers desenhados e testados no Laboratório de Biologia Molecular aplicada à Zoonoses (FMVZ, Unesp-Botucatu) com base na região do gene de 16S rRNA. Este estudo incluiu 1067 animais. Foram detectados seis casos de infecção intramamária por K. pneumoniae em seis diferentes animais em duas fazendas. Ainda, K. pneumoniae foi isolada em 77 swabs (34 de camas em 9 propriedades, 7 de salas de pré-ordenha em 5 propriedades, 6 de salas de ordenha em 4 propriedades, 11 do reto de animais em 6 propriedades e 19 de membros posteriores em 7 propriedades. A análise molecular confirmou o agente K. pneumoniae. K. pneumoniae foi isolada pelo menos em uma localização em todas as propriedades leiteiras., salientando a necessidade de manter a higiene nas fazendas leiteiras a fim de controlar a mastite por esse patógeno...

Beta-lactamase detection in Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus isolated from bovine mastitis / Detecção de beta-lactamase em Staphylococcus aureus e Staphylococcus coagulase negativa isolados de mastite bovina

The objectives of the study were to evaluate the presence/production of beta-lactamases by both phenotypic and genotypic methods, verify whether results are dependent of bacteria type (Staphylococcus aureus versus coagulase-negative Staphylococcus - CNS) and verify the agreement between tests. A total of 200 bacteria samples from 21 different herds were enrolled, being 100 CNS and 100 S. aureus. Beta-lactamase presence/detection was performed by different tests (PCR, clover leaf test - CLT, Nitrocefin disk, and in vitro resistance to penicillin). Results of all tests were not dependent of bacteria type (CNS or S. aureus). Several S. aureus beta-lactamase producing isolates were from the same herd. Phenotypic tests excluding in vitro resistance to penicillin showed a strong association measured by the kappa coefficient for both bacteria species. Nitrocefin and CLT are more reliable tests for detecting beta-lactamase production in staphylococci.

Os objetivos do presente estudo foram avaliar a presença/produção de beta-lactamases por ambos os métodos fenotípicos e genotípicos, verificar se os resultados são dependentes do tipo de bactéria (Staphylococcus aureus contra Staphylococcus coagulase negativa - CNS) e verificar a concordância entre os testes. Um total de 200 amostras bactérianas oriundas de 21 rebanhos distintos foram incluídos, sendo 100 CNS e 100 S. aureus. A presença/detecção de beta-lactamase foi realizada por diferentes testes (PCR, teste trevo (clover leaf test) - CLT, disco Nitrocefin e resistência in vitro à penicilina). Os resultados de todos os testes não foram dependentes do tipo de bactérias (CNS ou S. aureus). Vários isolados de S. aureus produtores de beta-lactamase eram de um mesmo rebanho. Testes fenotípicos excluindo resistência in vitro à penicilina mostraram uma forte associação medida pelo coeficiente kappa para ambas as espécies de bactérias. Nitrocefina e CLT são testes mais confiáveis para detectar a produção de beta-lactamase em estafilococos.

Molecular epidemiology and extended-spectrum Beta-lactamases production of Klebsiella pneumoniae isolated from three dairy herds / Epidemiologia molecular e produção de Beta- lac-tamases de espectro estendido de Klebsiella pneumoniae isoladas de três propriedades leiteiras

The objectives of this study were to isolate Klebsiella pneumoniae from different sources in three dairy cattle herds, to use the pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) to measure genotypic similarities between isolates within a dairy herd, to verify the production of extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) by the double-disk synergy test (DDST), and to use the PCR to detect the main ESBLs subgroups genes. Three dairy farms were selected based on previous mastitis outbreaks caused by K. pneumoniae. Milk samples were collected from lactating cows and from the bulk tank. Swabs were performed in different locations, including milking parlors, waiting room, soil, animal's hind limbs and rectum. K. pneumoniae was isolated from 27 cases of intramammary infections (IMI) and from 41 swabs. For farm A isolates from IMI and bulk tank were considered of the same PGFE subtype. One isolate from a bulk tank, three from IMI cases and four from environmental samples were positive in the DDST test. All eight DDST positive isolates harbored the bla shv gene, one harbored the bla tem gene, and three harbored the bla ctx-m gene, including the bulk tank isolate. Our study confirms that ESBL producing bacteria is present in different locations in dairy farms, and may be responsible for IMI. The detection of ESBLs on dairy herds could be a major concern for both public and animal health.

Os objetivos deste estudo foram isolar Klebsiella pneumoniae de diferentes localidades em três propriedades leiteiras, utilizar a eletroforese em campo pulsátil para averiguar similaridades genotípicas entre os isolados de uma mesma propriedade, verificar a produção de beta-lactamases de espectro estendido (ESBLs) pela prova da disco-difusão dupla associada (DDST) e utilizar a PCR para detecção dos principais subgrupos genéticos de ESBLs. Três propriedades leiteiras foram selecionadas baseando-se em surtos prévios de mastites causadas por K. pneumoniae. Amostras de leite foram coletadas de vacas em lactação e do tanque de expansão. Swabs foram realizados em diferentes localidades, incluindo salas de lactação, salas de espera, solo, reto e membros posteriores de animais. K. pneumoniae foi isolada de 27 casos de infecções intramamária (IMI) e de 41 swabs. Para a propriedade A os isolados de IMI e do tanque de expansão foram considerados do mesmo subtipo molecular. Um isolado do tanque de expansão, três de casos de IMI e quatro de amostras ambientais foram considerados positivos no teste da DDST. Todos os oito isolados DDST positivos portavam o gene bla shv, um portava o gene bla tem, e três portavam o gene bla ctx-m, incluindo um isolado de tanque de expansão. Nosso estudo confirma que bactérias produtoras de ESBLs estão presentes em diferentes localidades em propriedades leiteiras, e podem ser responsáveis por quadros de IMI. A detecção de ESBLs em propriedades leiteiras pode representar uma grande preocupação para saúde pública e para a saúde animal.

Breed and season influence on milk quality parameters and in mastitis occurrence / Influência da raça e estação em aspectos de qualidade do leite e na ocorrência de mastites

The aims of the present study were to evaluate the performance of Jersey and Holstein cows under different rainfall conditions (dry and rainy seasons) by monitoring aspects related to subclinical mastitis (somatic cell count, microbiological isolation, type of isolated pathogen), milk quality (lactose, protein, fat, total solids) and production (mean milk production) of both breeds. The study was carried out in a dairy farm located in the state of São Paulo, Brazil. Eight visitations were done to the farm, four in a period of high rainfall and four in a period of low rainfall. Milk samples were collected from 79 Holstein cows and 37 Jersey cows for electronic somatic cell count and determination of the main milk components (protein, fat, total solids, lactose). Milk fat, protein, total solids and production were influenced by breed and the season, with similar tendencies for both breeds in both seasons. Somatic cell count (SCC) showed similar results for both breeds. Holstein cows with intramammary infections (IMI) presented a higher increase in SCC when compared to Jersey cows (P<0.001). In the dry season, 53 animals had IMI in at least one month during the study, which 32 were Holstein and 21 were Jersey cows. In the rainy season, 65 animals had intramammary infection, being 43 Holstein and 22 Jersey cows. The frequency of IMI cases was larger in the rainy season than in the dry season. Jersey cows had a lower chance of showing IMI signs and symptoms than Holstein cows in the rainy season (odds ratio=0.52). The larger number of IMI cases in the rainy season may have led to a lower milk lactose rate for both breeds, thus milk lactose rate can be considered an indicator of IMI status. There was prevalence of contagious pathogens overall in the study. The applied model showed that environmental pathogens were more frequently isolated from the breed Jersey, regardless of the study season. There seems to be differences in the immune response of Jersey and Holstein breeds.

Os objetivos do presente estudo foram avaliar a performance das raças Jersey e Holandesa em diferentes condições de pluviosidade (estações seca e chuvosa) através do monitoramento de aspectos relacionados com a mastite subclínica (contagem de células somáticas, isolamento microbiológico, tipo de patógeno isolado), qualidade do leite (lactose, proteína, gordura e sólidos totais) e produção (media da produção de leite) de ambas as raças. O estudo foi conduzido em propriedade leiteira localizada no estado de São Paulo, Brasil. Oito visitas foram realizadas a propriedade, quatro em período de alta pluviosidade e outro em período de baixa pluviosidade. Amostras de leite foram colhidas de todos os animais para contagem eletrônica de células somáticas e determinação dos principais componentes do leite (proteína, gordura, sólidos totais, lactose). Gordura, proteína, sólidos totais e produção leiteira foram influenciadas tanto pela raça como pela estação, apresentando tendências similares para ambas raças em ambas estações. A contagem de células somáticas (CCS) apresentou resultados similares para ambas as raças. Vacas holandesas com infecção intramamária (IIM) apresentaram um maior aumento na CCS quando comparadas as vacas Jersey (P<0.001). Na estação seca, 53 animais tiveram IIM em pelo menos um mês do estudo. Destes, 32 eram da raça Holandesa e 21 da raça Jersey. Na estação chuvosa, 65 animais possuíram infecção intramamária, dos quais 43 eram da raça Holandesa e 22 da raça Jersey. A frequência de casos de IIM foi maior na estação chuvosa em comparação à estação seca. Vacas Jersey apresentaram uma menor chance de desenvolver sinais e sintomas de IIM em relação às vacas holandesas na estação chuvosa (razão de chances=0.52). O maior numero de casos de IIM na estação chuvosa pode ter contribuído para uma menor taxa de lactose no leite para ambas as raças, sendo que esta pode ser considerada como um indicador do status de IIM. Existiu uma prevalência de patógenos contagiosos durante todo o experimento. O modelo estatístico aplicado mostrou que patógenos ambientais foram mais frequentemente isolados da raça Jersey, independentemente do período do estudo. Aparentemente existem diferenças na resposta imune das raças Jersey e Holandesa.